图1 N^α过度乙酰化反应

2. 三氟乙酰化

三氟乙酰化副反应在多肽合成中更为普遍，主要源于三氟乙酸（TFA）与氨基或羟基的反应。该反应常发生在肽段从树脂切割、侧链全脱保护以及Boc固相合成法中反复脱保护的步骤中。

如，采用 Boc固相合成法进行多肽合成时，反复用三氟乙酸进行脱Boc保护基，可能导致肽链与树脂之间的酯键过早断裂，形成三氟乙酸酯衍生物，在后续的碱性环境中，发生O→N酰基迁移，形成三氟乙酰基封端的短肽杂质（图2）。同样，在处理丝氨酸、苏氨酸等含有羟基的氨基酸残基时，也会经历上述O→N酰基迁移过程。

图2 O→N酰基迁移引发的三氟乙酰化反应

氨基甲酰化是一种常规的蛋白质修饰策略，目前，源自各种过程的氨基异常甲酰化对多肽合成产生了不良影响。甲酰化副反应主要由色氨酸侧链保护基残留、甲酸试剂引入以及DMF溶剂降解三方面因素引起。

1. 保护基残留

在Boc固相合成法中，色氨酸常使用甲酰基进行侧链保护。在含有赖氨酸的肽链中，若脱保护不完全，残留的甲酰基可能迁移至赖氨酸侧链或肽链主链氨基上。

2. 试剂引入

在多肽合成中，甲酸常用于Boc脱保护或作为液相色谱流动相添加剂。在含有色氨酸的肽序列中，使用甲酸脱除Boc保护时，会导致色氨酸侧链上的吲哚发生甲酰化反应，生成副产物（图3）。不过此过程是可逆的，可以在适当条件下再生。

图3 甲酸脱Boc引发的甲酰化副反应

此外，当甲酸用作催化剂或洗脱剂时，在特定条件下，也可能引发不必要的甲酰化副反应。

3. 溶剂降解

DMF是甲酰化的主要来源之一，也是多肽合成中常用的有机溶剂（现已被管控）之一。

一方面，DMF在高温或强酸强碱条件下可能降解产生甲酸，从而引发甲酰化副反应。

另一方面，DMF在特定条件下会直接参与反应，形成相应的甲酰胺衍生物。如：在咪唑（或CDI）存在的情况下，氨基酸及其酯可直接与DMF反应得到甲酰胺化的产物（图4）。

图4 咪唑催化DMF与氨基酸及其酯发生甲酰化反应

另外，在多肽合成试剂（如PyBroP）存在下，DMF可能通过类Vilsmeier-Haack反应机制直接导致游离氨基甲酰化，终止肽链延伸（图5）。同样，在三氯氧磷等活性酰卤试剂存在下，DMF也可能会转化成相应的亚胺鎓衍生物，促进甲酰化反应。

图5 PyBrop/DMF引发的甲酰化反应

图6 Fmoc保护基脱除过程中的副反应

另外，烯丙氧羰基（Alloc）保护基的脱除通常采用Pd(0)催化。若反应体系中缺乏高效的烯丙基清除剂，新游离的氨基可能与中间体π-烯丙基钯络合物发生反应，生成N-烯丙基化副产物（图7）。

图7 Alloc保护基脱除过程中的烯丙基化

2. 甲醛诱导的交联与烷基化

甲醛是多肽合成中N-烷基化副反应的主要因素之一，其来源通常是在制备过程中产生或者有机溶剂残留。甲醛不仅能修饰特定的氨基酸，还能通过亚甲基桥使两个氨基酸或一个氨基酸内的两个官能团交联，使产物复杂化。需注意的是，甲醛介导的亚甲基桥交联反应需要在高pH环境下进行，一旦 pH 值降低到某个阈值以下，该过程即停止。

多肽合成是一项精细的系统工程，氨基基团的副反应贯穿于保护、偶联、切割及纯化等多个环节。深入理解这些副反应的化学原理，严格控制原料纯度，优化保护基策略及工艺参数，是提升多肽药物质量与收率的关键所在。