肉毒素治癌？ - 股票复盘网

提到肉毒杆菌毒素（肉毒素），很多人想的是美容院里用来抚平皱纹的医美产品，抑或是用于暗杀的致命生物毒素。

不过，最近一篇发表于Nature Biotechnology的文章中，研究人员成功将肉毒杆菌神经毒素X型（BoNT/X）的蛋白酶重新编程，使其能够精准切割癌细胞内的关键死亡开关caspase-1和gasdermin D，从而触发癌细胞的炎性细胞死亡。

改写狙击目标

肉毒毒素本质上是一种“狙击型”蛋白酶。它的主要天然目标是神经细胞中的VAMP蛋白家族。一旦通过其独特的结构进入神经细胞，它就会精准地切断VAMP蛋白，阻断神经信号传递，导致肌肉麻痹。

而另外一方面，细胞分为两种死亡方式，一种是凋亡，另外一种是焦亡，癌细胞往往对凋亡产生了抵抗力，这也是传统化疗药物常常失效的原因之一，而另外一种焦亡能够激活强烈的抗肿瘤免疫反应，因此成为癌症治疗领域备受瞩目的新策略。焦亡由一种叫做caspase-1的蛋白酶启动，一旦被激活，caspase-1会切割gasdermin D蛋白，后者在细胞膜上形成孔洞，导致细胞裂解。

研究人员这里的想法就是改变肉毒素蛋白酶的底物特异性，使其能被用于抗癌，这里用到了噬菌体辅助连续进化（PACE）技术。

PACE技术

自然界中，酶的功能进化往往需要数百万年的随机突变和自然选择。但PACE技术就像一个实验室中的达尔文进化加速程式，能够在实验室里强迫肉毒毒素蛋白酶在数十乃至数百代中快速“进化”。

具体来说，研究人员将目标蛋白酶（也就是肉毒素蛋白酶）的基因插入到M13噬菌体的基因组中，替代了原本对噬菌体繁殖至关重要的gIII基因。宿主大肠杆菌细胞内则携带一个报告系统，这种报告系统涵盖一种特殊的T7 RNA聚合酶，它通过一个可被切割的链接子与一个抑制剂（T7溶菌酶）连接在一起。当蛋白酶成功切割这个链接子中的目标底物序列时，聚合酶被解放，开始转录gIII基因，噬菌体得以繁殖。切割效率越高，噬菌体复制得越快。如果蛋白酶切割了不该切割的脱靶序列，它会激活一个“显性负性”gIII突变体的表达，这种突变体会阻止噬菌体从宿主细胞表面脱离。

也就是说，只有能切割目标蛋白（比如procaspase-1）的蛋白酶，才能帮助病毒复制。其他无法完成任务的蛋白酶，其对应的病毒就会被稀释淘汰。

两种路径

既然细胞焦亡常常通过caspase-1和gasdermin D展开，因此研究人员分别围绕这两个靶点开展了两条路线。

caspase-1是焦亡机制的核心，但在细胞内它以无活性的前体形式（procaspase-1）存在，需要被切割才能激活。因此在第一条路线中，研究人员希望让BoNT/X蛋白酶学会切割procaspase-1的内部连接区域。

然而，procaspase-1的序列与BoNT/X的天然底物VAMP1几乎没有相似之处。直接进化难度太大。研究人员采取了“垫脚石”策略，具体策略是先创造一系列中间序列，然后逐步引导蛋白酶适应新的底物。

第一步，他们设计了一个只改变一个氨基酸的“垫脚石1号”（PC_SS1），让BoNT/X先学会切割这个稍微不同的序列。经过72小时的PACE进化，Thr167Ala、Pro174Leu和Ser240Asn等几个关键突变出现了，它们聚集在底物结合槽附近。

接着，研究人员逐步提高难度，引入更多procaspase-1的序列特征。经过多轮PACE和PANCE（非连续进化）交替进行，蛋白酶逐步获得了切割更接近天然procaspase-1序列的能力。最终，通过引入针对天然底物VAMP1的负向选择，成功进化出了名为X(PC)的变体。

X(PC)不仅高效切割procaspase-1，还完全丧失了对VAMP1的活性。意外的是，X(PC)并没有在预期的位置切割procaspase-1，而是在Glu314和Asp315之间下刀。这种位点漂移的特性恰恰说明了进化过程的不可预测性和创造性。

科学家们用同样的策略，将进化目标直接瞄准了gasdermin D。他们再次利用PACE技术，引导肉毒毒素蛋白酶去识别并切割gasdermin D中间那段关键的、用于在细胞膜上穿孔的连接区。

这条进化之路更为崎岖。早期的变体虽然在简单测试中表现良好，但却无法切割长的、更接近天然形态的gasdermin D片段。研究团队不得不反复调整筛选策略，使用更长的底物序列，并引入更严苛的负面筛选，才最终获得了一系列能够高效切割gasdermin D的变体。经过进一步的工程改造和优化，最强的变体X(GD) 终于诞生了。虽然X(GD)的催化效率不如X(PC)，但它对gasdermin D表现出高度的特异性。

从弹头到运输

拥有了高效的蛋白酶弹头后，下一个挑战是如何将其精准地投送到癌细胞内部，而不伤及无辜的正常细胞。

事实上，肉毒毒素天生就具有自我递送的能力，这得益于它的另一个结构域——转运结构域（HN）。这个结构域能帮助蛋白酶穿过细胞膜，进入细胞内部。科学家们将改造好的X(PC)和X(GD)蛋白酶，与这个转运结构域重新组合在一起，构建了一个精简版的毒素系统。

实验结果表明，这个精简毒素系统能够高效地杀死多种白血病和实体瘤细胞系。至关重要的是，它对正常的非癌细胞（如HEK293T细胞）几乎没有任何毒性作用。这证明了通过去除天然的神经细胞靶向结构域，并仅保留其穿膜功能，可以极大地提高其对癌细胞的选择性杀伤力。

为了进一步验证其广谱抗肿瘤潜力，研究团队在一个包含475种人类癌细胞系中测试了X(PC)。结果显示，对X(PC)敏感的细胞系中，caspase-1的表达水平显著更高，这证明caspase-1确实是一个有效的疗效预测生物标志物。同时，那些增殖快、处于免疫激活状态的癌细胞系，也更容易被X(PC)杀死。

最后研究人员从体外实验扩展到体内实验，他们选取的是KPCY 6419c5小鼠胰腺导管腺癌细胞系。这是一种极其顽固的冷肿瘤模型，对现有的联合化疗免疫治疗方案完全耐药。

研究人员将X(PC)基因稳定整合到KPCY细胞中，并通过多西环素诱导表达。在培养皿中，X(PC)诱导了超过20%的细胞发生裂解性死亡，而野生型BoNT/X毫无效果。质谱证实，X(PC)能够精准切割小鼠caspase-1。

随后，这些工程化癌细胞被移植到小鼠体内。当肿瘤生长到可测量大小后，研究人员通过注射多西环素诱导X(PC)表达。结果令人瞩目：与对照组相比，治疗组的肿瘤体积在实验后期出现了统计学上极显著的缩小（P < 0.0001）。这是在一个连最强联合疗法都束手无策的模型中实现的突破。

未来开发

这项技术距离成为临床上的一线疗法还有很长的路要走。当前版本的蛋白酶在体内的稳定性和对正常组织的长期毒性仍需进一步评估。另外，其递送系统主要针对血液瘤，对实体瘤还需开发更高效的靶向策略。此外，如何在最大效力与最小脱靶效应之间取得最佳平衡，也是未来优化的重要课题